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| 快速純化大量RNA的新方法 |
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| 點擊次數(shù)：849 更新時間：2011-09-29 |
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RNA的結(jié)構(gòu)學(xué)研究，比如X射線晶體衍射或者核磁共振（NMR），都需要制備毫克級的高純度RNA。
RNA的大量合成一般是利用T7 RNA聚合酶對DNA模板進行體外轉(zhuǎn)錄，不過隨后的純化非常困難且耗時。利用高速液相層析系統(tǒng)（FPLC）的分子排阻層析能夠從RNA產(chǎn)物中有效去除未摻入的NTP、中斷的小轉(zhuǎn)錄本及模板DNA，但是需要多個準(zhǔn)備步驟，如酚/抽提，以去除T7 RNA聚合酶，以及脫鹽和樣品濃縮。
英國劍橋醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實驗室的Laura Easton等開發(fā)出一種快速、大規(guī)模純化結(jié)構(gòu)上均 一的RNA的新方法。這種方法利用的是弱陰離子交換層析，它省略了上述這些繁瑣的步驟，更快速地純化大量RNA。文章發(fā)表在《RNA》雜志上。
整個過程如下：利用T7 RNA聚合酶對線性的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)錄之后，加入EDTA終止反應(yīng)，并直接上樣到DEAE-Sepharose FPLC柱上。zui初的流出液含有T7 RNA聚合酶及rNTP。之后一次洗脫出短的中斷轉(zhuǎn)錄本、期望得到的RNA和質(zhì)粒DNA。RNA的純度和均一性由分子排阻層析來驗證，而蛋白凝膠電泳證實了純化的RNA中不含T7 RNA聚合酶。
利用這種新方法，研究人員能夠在4小時內(nèi)純化長度在30-500 nt的體外轉(zhuǎn)錄RNA，RNA的回收率達90%以上。如果單體RNA和低聚RNA有著足夠的電荷差異，那么也能將兩者區(qū)分開。
此技術(shù)既排除了酚/抽提，也不需要對RNA變性，不僅簡單省時，還能省錢。因為同位素標(biāo)記的rNTP能夠很輕松地從柱流出液中回收利用，這樣又能節(jié)省一筆費用。 |
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