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原位雜交操作流程說明

一、使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交*天：
1、 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2、 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
3、 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
4、 PBS清洗3分鐘；
5、 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6、 PBS清洗10分鐘；
7、 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘；
8、 PBS清洗2次，每次3分鐘；
9、 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10、PBS清洗2次，每次3分鐘；
11、0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12、PBS清洗2次，每次5分鐘；
13、預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14、準(zhǔn)備核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
15、雜交；第二天
16、將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
17、PBS清洗3分鐘；
18、RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
19、PBS清洗5分鐘；
20、室溫，2×SSC清洗10分鐘；
21、37℃，1×SSC清洗10分鐘；
22、37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
23、緩沖液A孵育10分鐘；
24、緩沖液A（1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100）孵育30分鐘；
25、加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液），37℃孵育3 小時(shí)；
26、緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
27、緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
28、制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長到16小時(shí)；
29、停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；
30、固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
二、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交*天：
1、 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2、 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
3、 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
4、 PBS清洗5分鐘；
5、 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6、 PBS清洗5分鐘；
7、 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘；
8、 PBS清洗2次，每次5分鐘；
9、 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10、PBS清洗2次，每次5分鐘；
11、0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12、PBS清洗5分鐘；
13、預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14、準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針； 
15、雜交；第二天
16、將玻片置于SSC中以去除封片；
17、室溫，2×SSC清洗10分鐘；
18、37℃，1×SSC清洗10分鐘；
19、37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
20、緩沖液A孵育10分鐘；
21、緩沖液A孵育30分鐘；
22、加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；
23、緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
24、緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
25、制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長到16小時(shí)；
26、停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；
27、固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。