研生試劑-FITC（異硫氰酸熒光素）
異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構體，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質結合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。
FITC 是在熒光素的基礎上通過化學反應增加硫氰酸基團得到的，硫氰酸基團可以和生物活性物質例如蛋白質上的伯胺基團反應形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對生物活性物質的熒光標記
FITC相關事項
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38
性質：
1. 外觀：黃色粉末
2. 純度：≥95% （HPLC）
3. 產(chǎn)品描述：FITC能和各種抗體蛋白結合，結合后的抗體不喪失與一定抗原結合的特異性，并在堿性溶液中具有強烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測。用于醫(yī)學，農(nóng)學和畜牧等方面，可對由細菌病毒和寄生蟲等所致疾病進行快速診斷。
4. FITC標記抗體流程：
（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對交聯(lián)反應液透析三次4℃，至pH=9.0。交聯(lián)反應液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應新鮮配制，避光。
（3）按P:F（蛋白質:FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L， 4 ℃終止反應2 h。
（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交聯(lián)物的鑒定
蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，該值應介于2.5 ~ 6.5之間。
（7）FITC交聯(lián)的蛋白應置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。 儲存條件：4℃避光保存
FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見下表。
Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm)
FITC 492 520
當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時，主要是蛋白質上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般zui多能結合15～20個，一個IgG分子可結合2～8個分子的FITC，其反應式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質
常用Marsshall(1958)法標記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標記法或Clark等(1963)的透析標記法。
1．Marsshall法
(1)材料 抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步驟 ①抗體的準備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。
②熒光素的準備 根據(jù)欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
b．總蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
f． PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。
③結合(或標記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析 結合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。
⑤過柱 取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標記蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)試劑和材料 抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步驟 ①抗體準備 用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。
②熒光色素準備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。
③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結合(在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌)18～24h。
④透析和柱層析 方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)試劑和材料 ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸餾水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液配法 取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
④其他試劑和材料 l％*、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步驟 ①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。
②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C
下電磁攪拌12～14h。
③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。
④將制備好的熒光抗體加*o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。
4．透析標記法
此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。
(1)試劑和材料 試劑和材料同改良法。
(2)方法及步驟 ①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。
②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。
③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。
